Proteinisolation

Im Laufe des Projektes kamen wir auf unterschiedlichste Weise mit Proteinen in Berührung. Anfangs, als wir vor allem auf Kohlenhydrate konzentriert waren, waren Proteine vor allem lästige Bestandteile in unseren Lösungen, die es aus dieser zu entfernen galt. Dies wurde vor allem durch eine Fällung mit Kalkmilch (Ca(OH)2(aq)) erreicht. Dabei wird durch das Calciumhydroxid der pH-Wert so stark erhöht, dass die meisten Proteine denaturierten und ihre Löslichkeit verloren. Calciumcarbonatpartikel, welche aus der Kalkmilch ausfallen, nachdem Luft durch diese geleitet wird, reißen denaturierte Proteine zudem aus der Lösung mit. Das Calciumcarbonat entsteht dabei durch folgende Reaktion:

CO2 + H2O ⇌ H2CO3

Ca(OH)2(aq) + H2CO3 ⇌ CaCO3(s)↓ + 2 H2O

Bzw.:  Ca(OH)2(aq) + CO2  ⇌  CaCO3(s)↓ + H2O

Die Proteine und Calciumcarbonat-Partikel können aus der Lösung mit Hilfe einer Zentrifuge entfernt werden (in unserem Fall bei 5000 rpm für 30 min). Die zurückgebliebene Lösung (Überstand im Zentrifugenröhrchen) ist sehr proteinarm, sodass wir zumindest mit unseren Methoden keine nennenswerte Proteinkonzentrationen  mehr nachweisen konnten.

Mit voranschreitender Zeit des Projektes stieg aber das Interesse daran, Proteine aus den Algen zu isolieren. Ausschlaggebend dafür war vor allem die Entdeckung, dass aus einigen unserer Ansätze ein farbiges Protein sezerniert wurde, nämlich das Phycocyanin.

Bei dem Phycocyanin handelt es sich um ein Pycobiliprotein, welches als akzessorisches Pigment in Blaualgen (Cyanobakterien) vorkommt und dort die Photosynthese der Blaualge unterstützt. Als ein akzessorisches Pigment absorbiert das Phycocyanin Licht in Wellenlängenbereichen, in denen die Chlorophylle selbst kein Licht absorbieren (Grünlücke). Auf diese Weise können Cyanobakterien in Wassertiefen, in denen vom Wasser schon viele Wellenlängen absorbiert wurden, das verbliebene Spektrum gut ausschöpfen. Chemisch gesehen handelt es sich bei dem Chromophor des Phycocyanins um ein Derivat der Gallenfarbstoffe und er geht aus dem Biliverdin hervor. Es besitzt ein Proteinrückrat (R steht im Fall der Abbildung für einen Proteinrest) über welches es wie alle anderen Proteine auch gefällt werden kann.

Um Proteine nun fällen zu können, wurden von uns drei verschiedene Grundtypen der Fällung verwendet.

Zum einem kann eine Fällung durch Zugabe von kaltem Aceton erfolgen, wodurch das Protein in der gefällten Form denaturiert ist und erst wieder zurückgefaltet werden muss. Schonender ist das Verfahren des Aussalzens mit Ammoniumsulfat. Eine Fällung ist auch mir Perchlorsäure möglich.

Protein-Isolation mit Aceton-Fällung[1]

Eine frische Algenprobe wurde direkt zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wohingegen das Pellet in einem 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 7,2) mit 5 mM NaEDTA resuspendiert wurde. Die Zellen wurden nun aufgeschlossen indem entweder ein dafür vorgesehenes Laborgerät (z. B. Bead Beater) zum Einsatz kam oder indem die Zellen mit Seesand in einem Mörser zerrieben wurden. Zellfragmente wurden im nächsten Schritt durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min entfernt. Das Pellet konnte verworfen werden, die weiteren Arbeiten erfolgten mit dem nun proteinhaltigen Überstand. Dieser Überstand wurde mit eiskaltem Aceton vermischt (4 Volumeneinheiten Aceton auf eine Volumeneinheit Probe) und bei -17 °C inkubiert. In unseren Fällen reichte eine Inkubation von 15 min schon für den gewünschten Erfolg aus. Das kalte Aceton-Wasser-Gemisch wurde nun für 20 min bei 5000 rpm zentrifugiert, und man erhielt ein blaues Pellet, welches Phycocyanin enthielt, und einen grünlichen Überstand. Die grüne Farbe stammte dabei von den Chlorophyllen, welche in diesem Überstand enthalten waren und photometrisch bestimmt werden konnten. Das Phycocyanin-Pellet konnte in 1 ml einer konzentrierten Harnstoff/HCl-Lösung[2] resuspendiert und weiter untersucht werden. Die folgenden Untersuchungen umfassten photometrische Techniken, sowie Gelelektrophoresen. Eine Aufreinigung kann über eine Säulenchromatographie erfolgen.

Aussalzen mit Ammoniumsulfat

Das Aussalzen von Proteinen mittels Ammoniumsulfat (NH4)2SO4 ist schonender zu den Proteinen, da die Proteine nicht wie bei der vorherigen Methode denaturiert werden.

Um eine Aussalzung zu bewirken wurde Ammoniumsulfat in fester Form zu der Probelösung gegeben.

Das Ammoniumsulfat, welches sehr gut löslich ist, dissoziiert in seine Ionen, welche eine Hydrathülle ausbilden und damit den in der Lösung vorhandenen Proteinen Wasser entziehen, mit welchem sie sonst Wechselwirkungen eingegangen wären.

So können sich Proteine bei einer bestimmten Salzkonzentration nicht mehr in der Lösung halten und fallen aus. Diese ausgefallenen Proteine können mit Hilfe einer Zentrifuge von der Lösung abgetrennt werden.

Bei größeren Lösungsvolumen empfiehlt es sich das Ammoniumsulfat in kleinen Portionen zuzugeben, dieses zu lösen und dann neues Ammoniumsulfat zuzugeben bis eine Fällung des gewünschten Proteins beobachtbar ist. Bei kleineren Volumina zeigte sich uns, dass es auch ausreichte, wenn man zu 0,5 ml Probelösung 1 ml gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung zugab und diese für 10 min bei 6000 rpm zentrifugierte.

 

Fällung mit Perchlorsäure

Eine Fällung kann auch durch Zugabe von Perchlorsäure (HclO4) erreicht werden. Dazu gibt man zu einer Probelösung das gleiche Volumen an 10 % HclO4-Lösung. Man kann eine Fällung beobachten, welche nahezu 100 % der gelösten Proteine fällt und so sind im Überstand nach der nachfolgenden Zentrifugation, zumindest mit unseren Methoden,  keine Proteine mehr nachweisbar


[1] Dieses Verfahren beruht auf der Grundlage des Praktikums an der Universität Stuttgart bei Herrn Prof. Dr. Heyer und der Publikation „Protein an phycocyananin quantification“ diese baut auf folgende Publikationen auf: Glazer, A. N.: Phycobiliproteins, Methods Enzymol, 167 (1988), pp. 291-303 und

Xu, H., Vavilin, D. & Vermaas, W.: Small Cab-like proteins regulating tetrapyrrole biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, Plant Mol. Biol. 49 (2002), pp. 149-160

[2]  8 M Harnstoff und HCl(aq)(konz.) im Verhältnis 19:1 (v/v)

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