Gelektrophorese und isoelektrischer Punkt

Die Gelelektrophorese ist eine der wichtigsten Methoden der molekularen Felder der Biologie. Sie beruht auf der Eigenschaft von geladenen Teilchen, sich im elektrischen Feld zu bewegen. Dabei eignet sich die Methode z. B. zum Auftrennen von Nukleinsäuren (DNA und RNA), welche bei passendem pH-Wert (basisch gepuffert) eine negative Ladung an den Phosphatgruppen tragen. Aber auch Proteine können Ladungen tragen und damit im elektrischen Feld wandern. Die Ladung der Proteine ist dabei stark vom pH-Wert abhängig, da die Ladungen im Protein durch Carboxylgruppen (R-COOH) sowie Aminogruppen (R-NH2) entstehen. Diese Gruppen reagieren dabei wie folgt:

                        (1)       R-COOH + H2O       ⇌        R-COO- + H3O+

                        (2)       R-NH2 + H2O           ⇌        R-NH3+ + OH-

Im alkalischen pH-Wert (pH > 7) sind die meisten  Carboxylgruppen in ihrer deprotonierten Form (R-COO) vorhanden, während die Aminogruppen ebenfalls in ihrer deprotonierten Form (R-NH2) vorliegen. In einem alkalischen Milieu trägt ein Protein also tendenziell eine negative Ladung, welche von der deprotonierten Carboxylgruppe stammt. In einem sauren Milieu (pH < 7) ist das Umgekehrte der Fall. Die Carboxylgruppe liegt in protonierter Form (R-COOH) vor und auch die Aminogruppe ist protoniert (R-NH3+)und trägt nun eine positive Ladung. Somit sind Proteine und Peptide, sowie aber auch Aminosäuren in einem saueren Milieu tendenziell positiv geladen.

Wenn man diesen Gedanken weiter verfolgt, erkennt man, dass es auch einen pH-Wert geben muss, bei welchem das Protein keine Ladung trägt. In diesem pH-Wert liegt das Protein ungeladen vor, da die Carboxylgruppen protoniert und Aminogruppen deprotoniert sind. Dieser pH-Wert wird als isoelektrischer Punkt bezeichnet. Dieser isoelektrische Punkt ist bei den meisten Proteinen unterschiedlich und liefert deshalb bei der Identifikation eines Proteins wichtige Hinweise. Bei der 2D-Gelelektrophorese kommt der isoelektrische Punkt zum Einsatz, da bei dieser Methode das auf das Gel aufgetragene Proteingemisch zuerst in der ersten Dimension entlang eines pH-Gradienten aufgetrennt wird und auf der Gelposition, die dem Wert des isoelektrischen Punktes entspricht, liegen bleibt. In der zweiten Dimension werden die Proteine dann nach ihrer Masse getrennt.

In unserem Projekt hatte der isoelektrische Punkt hohe Bedeutung, da sich mit der Bekanntheit dessen Wertes, unser Verdacht um welches Protein es sich handeln könnte, erhärtete.

Die Messung des isoelektrischen Punktes wurde dabei mit einer Probe unserer blauen proteinhalteigen Flüssigkeit, von der wir zu diesem Zeitpunkt nur wussten, dass sie Proteine enthält, aber nicht genau welche, durchgeführt. Nun wurden mit Hilfe von Salzsäure (0,1 M) und Natronlauge (0,1 M) verschiedene pH-Werte in der Lösung eingestellt und der elektrische Leitwert dazu gemessen. Die Größen pH-Wert und elektrische Leitfähigkeit wurden in einem Diagramm in Mathematica 8 gegeneinander aufgetragen und interpoliert, wodurch folgendes Diagramm erhalten wurde:

Der Tiefpunkt dieses Diagramms bei pH = 4,8 entspricht hierbei dann dem gemessenen isoelektrischen Punkt, was ziemlich genau mit dem Literaturwert[1] des isoelektrischen Punktes von Allophycocyanin übereinstimmt, welcher bei 4,79 liegt, der kleinere Tiefpunkt bei pH = 4,5 deutet auf C-Phycocyanin hin (Literaturwert aus der gleichen Quelle: 4,46).

Um Probleme mit den unterschiedlichen Ladungen der Proteine bei unterschiedlichem pH-Wert bei einer Gelelektrophorese zu entgehen ist man dazu übergegangen, diese meist zusammen mit Natriumlaurylsulfat (SDS) zu vermengen, bevor sie auf das Gel aufgetragen werden. SDS denaturiert als amphiphiles Molekül das Protein, indem es die hydrophoben Wechselwirkungen des Proteins, welche es sonst zusammenhalten, stört. Das Protein nimmt dadurch eine Stäbchenform an. Ebenfalls bindet viel SDS an die Proteine (in einem Verhältnis von 1,4 g SDS auf 1 g Proteinmasse (entspricht einem SDS pro zwei Aminosäuren)[2]). Durch die starke negative Ladung des SDS wird die natürliche Proteinladung überdeckt und das Proteingemisch kann in einem Gel nun gemäß seiner Masse, ohne großen Einfluss des isoelektrischen Punktes, aufgetrennt werden. Der negative Pol sollte bei einer SDS-Gelelektrophorese folglich immer am Startpunkt der Gelelektrophorese liegen, da die Proteine vom negativen Pol zum positiven Pol im elektrischen Feld durch die Gel-Matrix wandern werden.

Für unsere Gelelektrophoresen verwendeten wir ein Agarose-Gel (1,4%). Als Laufpuffer diente ein TRIS-Glycin-Puffer (siehe „Anhang“). Proben wurden vor dem Auftragen für 5 min bei 95 °C mit einem Volumenäquivalent von Laemmlipuffer (2x) (siehe „Anhang“) inkubiert und dann auf das Gel neben einer Markerspur[3] aufgetragen. Wir trugen jeweils 10 µl einer Probe auf das Gel auf. Eine Auftrennung erfolgte bei 45 V bis die vorangefärbte Bande des Markers (31 kDa) die Mitte des Gels erreicht hatte. Die Proteinbanden wurden dann mit Roti®-Blue, einem Präparat mit Coomassie-Brilliant-Blau, eingefärbt.

Unerfreulicher Weise entdeckten wir die Gelelektrophorese als passende Methode für unsere Forschungen erst zum Projektende, sodass leider noch keine zuverlässigen Messungen und Daten vorliegen.


[1] Literaturwert aus „Isolierung und Charakterisierung der Biliproteide von Rhodella violacea (Bangiophycidae)“ von Klaus P. Koller und Werner Wehrmeyer

[2] Wert aus „Lehrbuch der Biochemie (Zweite, aktualisierte und erweiterte Auflage)“ von den Autoren Donald Voet, Judith G. Voet und Charlotte W. Pratt von dem Verlag Wiley-VCH

[3] Der verwendete Marker war „Roti®-Mark 10-150 PLUS“ von Carl-Roth

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